Volume 3 Issue 4 will be published on Jul 12, 2022.   A Cell Press partner journal
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乙型肝炎病毒基因组整合的研究进展

全世界约2.57亿人正遭受着乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus, HBV)感染的困扰,其中大约1/3的感染者在中国。据2018年统计数据显示,我国在新发感染人数小幅度下降的情况下,乙型肝炎患者依旧在100万以上。HBV感染的防控仍是我国面临的一个重大公共卫生问题。HBV属于嗜肝DNA病毒,主要感染人的肝细胞,其慢性感染可导致慢性乙型病毒性肝炎(简称慢性乙肝),并可显著提高肝纤维化、肝硬化甚至肝癌的发病率(图1)。然而,目前并没有药物可以有效清除感染病毒,只能通过提前注射疫苗来防止感染。

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图1 三步曲:肝炎、肝硬化、肝癌

HBV慢性感染难以治愈的原因主要有两方面:
1、HBV感染产生的共价闭合环状DNA(covalently closed circularDNA, cccDNA)难以清除,持续存在。
2、HBV DNA可部分整合到人的基因组,稳定存在。

乙肝病毒基因组整合的研究进展

HBV线性双链DNA(double-stranded linear DNA, dslDNA)是HBV DNA整合的主要分子。dslDNA主要由HBV正义链 (+)-DNA的异常原位起始延伸产生(图2)。

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图2 HBV dslDNA的合成过程

dslDNA在底物整合进细胞的基因组之前,可能需要经过以下加工过程(图3):
1.去除(-)-DNA 5’端共价结合的HBV聚合酶蛋白(Pol)
2. 去除(+)-DNA 5’端的Cap结构
3. 补齐 (+)-DNA

细胞基因组双链断裂的位置被认为是HBV DNA整合插入的主要位点,非同源末端连接(nonhomologous end joining, NHEJ)和微同源介导的末端连接(microhomology-mediated end joining, MMEJ)被认为参与了HBV DNA整合插入的过程(图3)。

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图3 HBV dslDNA整合机制示意图

HBV DNA整合的相关研究模型

HBV DNA整合的现象在1980年首次被报道,当时采用的检测方法为Southern blot杂交。在之后40年的研究进程中,检测方法不断发展,主要有以下几种:

1. Southern blot杂交
2. 原位杂交(In Situ Hybridization)
3. 克隆构建及测序(Cloning and Nucleotide Sequencing)
4. 聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction, PCR)
5. 高通量测序技术(High-Throughput Sequencing Technology)

HBV DNA整合的相关研究模型

目前我们对HBV DNA整合的认知主要来源于两方面研究:HBV感染患者肝组织样品;其他嗜肝DNA病毒的非灵长类动物模型,如土拨鼠肝炎病毒感染土拨鼠的动物模型,鸭HBV感染鸭的动物模型。但随着HBV受体人牛磺胆酸酸钠共转移多肽(human sodium taurocholate cotransportingpolypeptide, hNTCP)被发现,一系列可支持HBV感染的细胞及动物模型被建立,这些新型的模型势必对HBV DNA整合的研究带来极大的便利和促进。

目前支持HBV感染的模型主要有以下几种:

细胞模型:
1.人原代肝细胞(Primary Human Hepatocytes, PHH)
2. 人肝干细胞系HepaRG及其hNTCP稳转细胞系(HepaRG-hNTCP)
3. hNTCP稳转人肝癌细胞系,如HepG2-hNTCP和Huh7-hNTCP细胞系
4.干细胞分化的肝细胞

动物模型:
1.黑猩猩
2. 表达hNTCP的猕猴
3. 树鼩
4. 人肝嵌合小鼠

HBV DNA整合在肝细胞癌中的作用

慢性HBV感染被认为是肝细胞癌(Hepatocellular Carcinoma, HCC)发生的一个重要风险因素。有研究指出乙肝患者发生肝癌的几率比未感染者高10-200倍,而HBV DNA整合在此过程中发挥着重要作用。与癌旁组织相比,HBV DNA的整合频率在肝癌细胞中更高(86.4% vs 30.7%)。HBV DNA整合在HCC的发生发展中所起作用的分子机制主要有以下几个方面:

1.插入突变,导致HCC相关基因的异常表达

2.破坏染色体的稳定性

3. HBV DNA部分整合导致截短或与宿主蛋白融合的病毒蛋白产生,导致细胞生理特性的改变及相关的病变,如全长或截短的HBsAg及HBx。

目前HBV治疗的目标是获得“功能性治愈”,即停止用药后,血清中持续检测不到HBV DNA;HBsAg的消失,伴随或不伴随HBsAg抗体的产生;正常的肝功能及组织形态。整合到细胞基因组中的HBV DNA可作为HBsAg产生的稳定模板,从而阻碍“功能性治愈”的实现。针对整合HBV DNA所转录出的转录本设计的siRNA相关药物,可能会对降低患者体内的HBsAg水平起到积极的作用。

总结与展望

在乙肝病毒被发现的55年里,科研人员对HBV DNA整合的研究取得了一定进展,但仍有一些问题亟待解决,如HBV DNA整合的具体分子机制,在HCC发生发展中的具体作用及机制等。新型HBV感染模型的建立将会对HBV DNA整合的研究带来极大的便利和促进。HBV DNA整合应作为一种临床检测指标,用来综合全面地评估HBV患者的疾病发生发展风险。为降低HBV DNA整合对HBV患者疾病的影响,需要重视针对HBV DNA整合的治疗手段及药物研发。同时降低患者肝细胞中cccDNA含量及削弱整合HBV DNA所带来的影响,将会更加有利于HBV“功能性治愈”的实现。

原文链接:https://www.cell.com/the-innovation/fulltext/S2666-6758(20)30034-5

作者简介

武汉大学基础医学院博士后赵凯涛为本文第一作者;武汉大学基础医学院夏宇尘教授为本文通讯作者。

夏宇尘:武汉大学病毒学国家重点实验室/基础医学院教授,博士生导师,主要从事乙型肝炎病毒的基础和转化相关研究,研究成果相继发表于Science、Gastroenterology、Journal of Hepatology、Hepatology、Journal of Clinical Investigation、Journal of Virology等学术期刊。

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ISSN 2666-6758
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